RNAeasy? Plus動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)

      離心柱式RNAeasy? Plus動物RNA抽提試劑盒(RNAeasy? Plus Animal RNA Isolation Kit with Spin Column)是一種基于離心柱法從動物組織或培養(yǎng)的動物細胞中**、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質量地抽提總RNA的試劑盒。總RNA包括大于200個核苷酸的RNA(也常被稱為總RNA)和小于200個核苷酸的小RNA(small RNA)。
      本試劑盒抽提得到的RNA可用于反轉錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實驗；也可用于基因表達芯片分析(microarray)、高通量測序(high throughput sequencing)等對RNA質量要求較高的情況。
      三款離心柱式及Trizol法RNA抽提試劑盒的主要特點和差異如下：

      動物組織或細胞中的RNA按照長度可以分為長鏈RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，長鏈RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。長鏈RNA按照是否編碼蛋白或多肽可以分為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非編碼的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
      本試劑盒抽提總RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA與小RNA，通過兩次特異性結合體系過同一純化柱，分別結合>200nt的RNA和<200nt的小RNA，同時有效避免了雜質大量析出而阻塞純化柱，抽提得到包括>200nt的RNA和小RNA的總RNA，基因組DNA和蛋白等雜質被有效去除，然后通過洗滌去除非特異性結合的蛋白等雜質，*后用洗脫液將總RNA洗脫下來。

      本試劑盒使用**。本試劑盒通過特殊的柱純化介質進行總RNA分離純化，能有效避免傳統(tǒng)的Trizol法抽提時使用的酚、氯仿等有毒有害有機試劑。
      本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無需繁瑣的RNA沉淀步驟，抽提操作過程僅25-30分鐘。相比于傳統(tǒng)的Trizol抽提法，本試劑盒的操作流程顯著簡化，縮短了抽提時間，降低了RNA降解的風險。
      本試劑盒抽提總RNA的得率高。本試劑盒的抽提效果經反復測試，100萬個凍存的HeLa細胞能抽提得到約15-20μg總RNA，5mg凍存的小鼠肝組織能抽提得到約6-10μg總RNA，5mg凍存的小鼠腎組織能抽提得到約3-5μg總RNA。不同來源的樣品可能有所差異，通常新鮮樣品的得率高于凍存樣品。本試劑盒的抽提效果參見圖2。

      圖2. 本試劑盒總RNA抽提效果。樣品為凍存的50萬個HeLa細胞、5mg小鼠肝組織和5mg小鼠腎組織。洗脫液用量均為40μl。均取6μl洗脫的樣品經變性處理后，在含6.67%甲醛和適量NA-Red的1.2%變性瓊脂糖凝膠中電泳約45分鐘后拍照。抽提產物的得率依次為9.6μg、8.5μg和4.1μg，A260/A280依次為2.11、2.10和2.09，A260/A230依次為2.01、1.98和1.94。實際抽提效果會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，本圖僅供參考。

注：純的RNA其A260/A280約為2.0，但在很多儀器上測定時會高于2.0，低于1.9通常認為有蛋白、DNA或者酚等的污染；純的RNA其A260/A230約為2.0左右或者略高，低于1.9通常認為有碳水化合物、胍鹽、多肽或酚等的污染。
      本試劑盒抽提得到的總RNA純度高，顯著優(yōu)于Trizol方法。抽提得到的總RNA的A260/A280通常為2.0-2.2。A260/A230通常為1.9-2.1。本試劑盒抽提獲得的RNA的實測純度參見圖2。
      本試劑盒適用于新鮮或凍存的動物組織或細胞總RNA與小RNA的抽提，推薦的細胞用量為50-100萬，組織用量為3-5mg。
      本試劑盒可用于50個樣品的總RNA(含小RNA)抽提。
包裝清單：

保存條件：
      室溫保存，一年有效。
注意事項：
      對于富含RNase的樣品(如動物組織)，建議使用前在裂解液中添加二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)至終濃度為40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巰基乙醇至終濃度為1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巰基乙醇)，含DTT或β-巰基乙醇的裂解液可在室溫放置1個月。
      通過本試劑盒抽提到的RNA已經去除絕大多數(shù)DNA，通常情況無需DNase處理。后續(xù)如進行某些對極少量DNA殘留較敏感的實驗，則需要在使用說明中步驟5離心后，在純化柱中加入適量DNase I (如80μl含10U DNase I的酶溶液，推薦使用的DNase I，D7076)，室溫消化15分鐘。消化結束后，不要離心，直接加入500μl洗滌液II，進入使用說明的步驟6進行操作。
      本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時應小心，避免被污染。所有自行準備的試劑和耗材也都應是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后高溫高壓**并烘干。操作時應避免對著樣品或所使用的試劑盒耗材呼氣或說話，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
      對于操作環(huán)境中RNA酶的去除，推薦使用生產的RNase and DNase Away (XY0123)以去除實驗桌面上或其它接觸面上的RNase。
      使用凍存的細胞或組織抽提RNA的效果通常比新鮮的細胞或組織差一些。因為在細胞或組織凍融過程中一些細胞或組織內的RNase會被釋放出來并剪切樣品中的RNA。對于組織樣品，推薦使用生產的RNALater?動物組織RNA穩(wěn)定保存液(XY0118)進行保存以保證樣品RNA的完整性。 
      本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。 
      廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。 
      結合液I、II和洗滌液II中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發(fā)，并須按照易燃試劑的相關規(guī)范進行存放和使用。 
      本產品**于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或**，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。 
      為了您的**和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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