產(chǎn)品及特點(diǎn)

本產(chǎn)品是在本公司即用型PCR試劑盒2.0的基礎(chǔ)上改良而來(lái)，內(nèi)含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反應(yīng)緩沖液、PCR增強(qiáng)劑、上樣染料等所有PCR所需要的成分, 用戶(hù)只需加入模板和引物即可進(jìn)行PCR反應(yīng), 具有廣泛的用途。

1. 擴(kuò)增效率和靈敏度更高。

2. 方便，用戶(hù)只需準(zhǔn)備模板和引物既可以進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。

3. 快捷，操作步驟已經(jīng)*大限度地簡(jiǎn)化，能減少污染，降低實(shí)驗(yàn)誤差。

4. 本產(chǎn)品A型含電泳染料,PCR反應(yīng)液可直接上樣電泳，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作。

5. 產(chǎn)物可直接用于T載體克隆，不需要額外的加A反應(yīng)。

6. 染料單獨(dú)提供，方便客戶(hù)組合。

規(guī)格及成分

注：本產(chǎn)品分A和B兩種

A型產(chǎn)品：PCR MagicMix 3.0中直接加入了專(zhuān)用染料；

B型產(chǎn)品：PCR MagicMix 3.0中沒(méi)有加入專(zhuān)用染料，染料單獨(dú)提供

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑

DNA模板、引物、超純水。

使用方法

 以30 uL的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系為例：在一干凈的PCR管中，加入下列成分：

放入PCR儀中進(jìn)行PCR, 結(jié)束后取5-10 uL直接上樣電泳（A型產(chǎn)品不需要額外再加DNA上樣液）, 紅色染料電泳速度相當(dāng)于50 bp DNA片段。B型產(chǎn)品用戶(hù)按照1.5 mL PCR MagicMix 3.0加入60 uL專(zhuān)用染料的比例將60 uL專(zhuān)用染料加入到1.5 mL PCR MagicMix 3.0中。

注意：

1．如果反應(yīng)體系不是30 uL，各成分需要等按比例增加或減少。

2．如果DNA模板中有PCR不明抑制物（植物、土壤和血液等DNA樣品常含此類(lèi)抑制物），可以在PCR體系中加入1/10的PCR抑制物**劑（CAT#：60804，30uL體系中加3uL），可能會(huì)對(duì)PCR有幫助。

相關(guān)資料

PCR反應(yīng)的影響因素

變性溫度與時(shí)間：模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為94℃ 20~30秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，*高變性溫度不宜超過(guò)95℃。

退火溫度與時(shí)間：退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45~68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的*適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30~60秒，足以使引物與模板之間完全結(jié)合，長(zhǎng)時(shí)間退火沒(méi)有必要。

延伸溫度與時(shí)間：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所用聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定，如同樣擴(kuò)增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分鐘，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)，時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

循環(huán)次數(shù)：可根據(jù)模板DNA的量、擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定20-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

酶量：50 μL反應(yīng)體系可用0.5-5 U酶，酶量的選擇與模板DNA的量，擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過(guò)多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過(guò)少時(shí)反應(yīng)性能下降。

模板：模板可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多，不超過(guò)1 μg為宜，因?yàn)榧恿窟^(guò)多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如，使用基因組為模板擴(kuò)增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。

引物：引物與模板配對(duì)的長(zhǎng)度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，*高不宜超過(guò)30個(gè)核苷酸，*佳長(zhǎng)度為20~24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5’端多加幾個(gè)堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端。如果可能，引物3’端*好富有GC，這樣退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物*好經(jīng)過(guò)色譜層析純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長(zhǎng)的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-2 μM左右，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

PCR Inhibitor Erasol (CAT#:60804)。