Hacat ；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞詳細(xì)說(shuō)明
細(xì)胞名稱(chēng) Hacat ；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞
生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)
形態(tài)特性 上皮樣
產(chǎn)品規(guī)格 1×10^6 cells/瓶
培養(yǎng)條件 DMEM-H+10%FBS+1%P/S
生長(zhǎng)條件 氣相：5%CO2 95% 空氣 溫度：37 ℃
凍存條件 90%FBS+10%DMSO
背景資料 該細(xì)胞源自一位62歲患有黑色素瘤男性的病灶外圍正常皮膚，角蛋白、角化細(xì)胞交聯(lián)外膜蛋白、中間絲相關(guān)蛋白陽(yáng)性。
Hacat ；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞常規(guī)說(shuō)明：
凍存液成分：10%DMSO+40%FBS+50%基礎(chǔ)培養(yǎng)液
細(xì)胞質(zhì)檢情況：不含**、**、支原體等微生物污染
傳代建議：1:2~1:3傳代，2~3天換液1次
特別提醒：簽收細(xì)胞后，如細(xì)胞狀態(tài)不佳，或培養(yǎng)中遇到問(wèn)題，煩請(qǐng)當(dāng)天盡快聯(lián)系，以便處理。當(dāng)天及時(shí)反饋細(xì)胞情況和細(xì)胞照片是售后跟蹤處理重要的參考依據(jù)，請(qǐng)務(wù)必重視。
一、 Hacat ；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞復(fù)蘇
1. 把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)。液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺(tái)里。
2. 把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來(lái)），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
3. 把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。
4. 標(biāo)好細(xì)胞種類(lèi)和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基。
5. 3天換一次培養(yǎng)基。
二、 Hacat ；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞傳代
1. 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代。
2. 把原有培養(yǎng)基吸掉。
3. 加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行），消化1-2分鐘。
4. 細(xì)胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。
5. 用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來(lái)。
6. 把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
7. 倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來(lái)。
8. 根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿中。一般，癌細(xì)胞分5個(gè)，正常細(xì)胞傳3個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)。
三、 Hacat ；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞凍存
把細(xì)胞消化下來(lái)并離心（同上）。用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來(lái)，分裝到**的凍存管中，靜止幾分鐘，寫(xiě)明細(xì)胞種類(lèi)，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃過(guò)夜，然后放到液氮灌中保存。
凍存液的配制： 70%的完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
要注意的就是無(wú)菌操作！
細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法
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問(wèn)題
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原因
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解決方案
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細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
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生長(zhǎng)培養(yǎng)基使用不當(dāng)
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按照生產(chǎn)商的建議，使用相應(yīng)的預(yù)熱生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
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生長(zhǎng)培養(yǎng)基中血清質(zhì)量差
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使用其他批次血清。
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傳代操作不當(dāng)
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按照生產(chǎn)商的建議消化時(shí)間及傳代比例進(jìn)行操作。
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換液過(guò)于頻繁
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降低換液頻率，參考生產(chǎn)商推薦的換液頻率。
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細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多
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使用傳代次數(shù)較少的健康細(xì)胞。
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細(xì)胞生長(zhǎng)超過(guò)匯合狀態(tài)
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哺乳動(dòng)物細(xì)胞傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行，建議細(xì)胞密度達(dá) 80-90%傳代。
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細(xì)胞被支原體污染
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將細(xì)胞、培養(yǎng)基和試劑丟棄；新取一只凍存細(xì)胞，并且使用新的培養(yǎng)基和試劑。
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細(xì)胞復(fù)蘇存活率低
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細(xì)胞凍存不當(dāng)
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新取一只凍存細(xì)胞，并儲(chǔ)存在液氮中。將細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，直至復(fù)蘇。
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自行制備的凍存細(xì)胞無(wú)活性
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將細(xì)胞按照生產(chǎn)商推薦的密度凍存。
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制備凍存細(xì)胞時(shí)使用傳代次數(shù)少的細(xì)胞。
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嚴(yán)格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序凍存細(xì)胞。請(qǐng)注意本手冊(cè)推薦的冷凍程序是凍存細(xì)胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。
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新取一只凍存細(xì)胞。
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細(xì)胞復(fù)蘇方法不當(dāng)
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嚴(yán)格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序復(fù)蘇細(xì)胞。請(qǐng)注意本手冊(cè)推薦的解凍程序是復(fù)蘇細(xì)胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。
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確保冷凍細(xì)胞解凍迅速，接種前用預(yù)熱的生長(zhǎng)培養(yǎng)基緩慢稀釋細(xì)胞。
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復(fù)蘇培養(yǎng)基使用不當(dāng)
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使用生產(chǎn)商推薦的培養(yǎng)基。確保培養(yǎng)基使用前已經(jīng)預(yù)熱。
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細(xì)胞稀釋過(guò)度
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按照生產(chǎn)商的建議，將解凍后的細(xì)胞高密度接種，以改善復(fù)蘇效果。
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處理細(xì)胞時(shí)動(dòng)作不夠輕柔
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凍存和復(fù)蘇過(guò)程對(duì)大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)造成不利影
響。不要通過(guò)渦旋振蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細(xì)胞脫落(培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)除外)，也不要高速離心細(xì)胞。
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凍存液中所用保護(hù)劑在儲(chǔ)存過(guò)程中未避光
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如果未避光儲(chǔ)存，凍存保護(hù)劑會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)；新取一只凍存保護(hù)劑，重新凍存細(xì)胞。
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